Desarrollo de estrategias dirigidasa modificarel metabolismo de Herbaspirillum seropedicae para mejorar la producciónde polihidroxialcanoatos
La contaminación ambiental generada por la acumulación de desechos plásticos y el agotamiento de las reservas de petróleo en un futuro incierto, ha promovido el desarrollo de materiales alternativos. Entre ellos se encuentran los polihidroxialcanoatos (PHAs), poliésteres de origen microbiano con pro...
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| description | La contaminación ambiental generada por la acumulación de desechos plásticos y el agotamiento de las reservas de petróleo en un futuro incierto, ha promovido el desarrollo de materiales alternativos. Entre ellos se encuentran los polihidroxialcanoatos (PHAs), poliésteres de origen microbiano con propiedades termoplásticas y biodegradables. Los microorganismos acumulan estos poliésteres como reserva de carbono y energía. Se sintetizan en condiciones desbalanceadas de crecimiento, en presencia de un exceso de fuente de carbono. Dentro de la familia de los PHAs se encuentra el poli-3-hidroxibutirato (PHB) y el copolímero compuesto por 3-hidroxibutirato y 3-hidroxivalerato P(3HB-co-3HV). La producción industrial de PHAs se inició en la década del 80 y actualmente varias compañías producen este material, en general a escala piloto, dados los altos costos de producción. El factor que más afecta el precio de los PHAs es el costo de la fuente carbonada. Para la síntesis de P(3HB-co-3HV) se suele utilizar la mezcla de un carbohidrato y ácido propiónico como fuentes de carbono. El propiónico se adiciona para generar el 3HV a partir del intermediario metabólico propionil-CoA. Para incrementar la eficiencia de síntesis de 3HV se han construido mutantes derivadas de los organismos productores incapaces de metabolizar propionil-CoA. Esta estrategia permitió obtener rendimientos detransformación del ácido propiónico cercanos al valor teórico. La cepa Z69 de Herbaspirillum seropedicae fue capaz de acumular PHB hasta 60% de su peso seco al crecer en glucosa en cultivos en lote. El rendimiento de transformación de glucosa en PHB (YPHB/glu) obtenido fue menor al 50% del rendimiento teórico. El objetivo de este trabajo de tesis fue optimizar la producción de PHB y P(3HB-co-3HV) por H. seropedicae Z69 mediante el aumento del rendimiento de transformación de glucosa y propionato de sodio en polímero. Se plantearon dos estrategias. Una de ellas abarca la eliminación de las rutas catabólicas del propionil-CoA mediante ingeniería genética. Se construyó un mutante (Z69Prp) en la enzima 2-metilcitrato sintasa (PrpC) del ciclo del 2-metilcitrato (2MCC) para el catabolismo del propionato, Z69Prp fue incapaz de crecer en propionato de sodio y en cultivos con glucosa-propionato fue capaz de acumular 50% de copolímero, con 8,6 mol% de 3HV, mayor al de la cepa control (1 mol%). El rendimiento obtenido fue 0,44 g/g, por debajo del rendimiento teórico (1,35 g/g). Este rendimiento teórico se calcula asumiendo que todo el ácido propónico se transforma en monómeros de 3HV. 4 En el caso de glucosa se implementó una estrategia de análisis de rutas metabólicas mediante análisis de modos elementales de flujos (AMEF). Se analizó el crecimiento y producción de PHB por la cepa Z69 en cultivos continuos y en lote en bio-reactor, utilizando glucosa como fuente de carbono. Los parámetros analizados en los cultivos continuos permitieron determinar que la acumulación de PHB está parcialmente asociada al crecimiento. Los cultivos en lote presentaron un perfil donde la fase exponencial se comportaba como un período pseudo-estacionario. Los datos de los cultivos continuos y del período pseudo-estacionario fueron usados para desarrollar un análisis de MEF. Los datos de los cultivos continuos generaron 9 modos elementales (ME) y los del cultivo en lote fueron 13. En ambos casos fue posible identificar un ME el cual se ajustó mejor a los datos experimentales, con un flujo de carbono por la vía de Embden Doudoroff (ED) lineal. Por otro lado, el ME que maximiza la producción de PHB posee el mayor flujo por la vía de ED cíclica. El funcionamiento cíclico de ED generaría más poder reductor como NADPH, lo cual está de acuerdo con los requerimientos de precursores para la síntesis de PHB. A partir de los MEF, se determinó una correlación positiva entre el flujo por la enzima fructosa 1,6 bifosfatasa (FbPasa) y el rendimiento de transformación de glucosa en PHB. El aumento en el número de copias del gen fbp que codifica para dicha enzima en Z69(pRK767::fbp) se tradujo en un leve aumento en la actividad fructosa 1,6 bifosfatasa. Los cultivos en lote en condiciones de bio-reactor de la cepa Z69(pRK767::fbp) presentaron una menor velocidad de crecimiento con un rendimiento YPHB/glu mayor que la cepa control. Sin embargo, el YPHB/glu obtenido fue muy bajo y alejado del valor esperado por el análisis de modos elementales de flujo. Este trabajo de tesis permitió avanzar en el conocimiento de H. seropedicae en cuanto a su metabolismo carbonado, fisiología y síntesis de PHAs. Esto permitirá diseñar una estrategia de cultivos (alimentados o continuos) que aumente la producción de PHAs y la eficiencia en el uso del sustrato carbonado |
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| spelling | Desarrollo de estrategias dirigidasa modificarel metabolismo de Herbaspirillum seropedicae para mejorar la producciónde polihidroxialcanoatosCatalán, Ana InésBIOQUIMICAMICROBIOLOGIAMETABOLISMOHERBASPIRILLUM SEROPEDICAEPOLIHIDROXIALCANOATOSSINTESISLa contaminación ambiental generada por la acumulación de desechos plásticos y el agotamiento de las reservas de petróleo en un futuro incierto, ha promovido el desarrollo de materiales alternativos. Entre ellos se encuentran los polihidroxialcanoatos (PHAs), poliésteres de origen microbiano con propiedades termoplásticas y biodegradables. Los microorganismos acumulan estos poliésteres como reserva de carbono y energía. Se sintetizan en condiciones desbalanceadas de crecimiento, en presencia de un exceso de fuente de carbono. Dentro de la familia de los PHAs se encuentra el poli-3-hidroxibutirato (PHB) y el copolímero compuesto por 3-hidroxibutirato y 3-hidroxivalerato P(3HB-co-3HV). La producción industrial de PHAs se inició en la década del 80 y actualmente varias compañías producen este material, en general a escala piloto, dados los altos costos de producción. El factor que más afecta el precio de los PHAs es el costo de la fuente carbonada. Para la síntesis de P(3HB-co-3HV) se suele utilizar la mezcla de un carbohidrato y ácido propiónico como fuentes de carbono. El propiónico se adiciona para generar el 3HV a partir del intermediario metabólico propionil-CoA. Para incrementar la eficiencia de síntesis de 3HV se han construido mutantes derivadas de los organismos productores incapaces de metabolizar propionil-CoA. Esta estrategia permitió obtener rendimientos detransformación del ácido propiónico cercanos al valor teórico. La cepa Z69 de Herbaspirillum seropedicae fue capaz de acumular PHB hasta 60% de su peso seco al crecer en glucosa en cultivos en lote. El rendimiento de transformación de glucosa en PHB (YPHB/glu) obtenido fue menor al 50% del rendimiento teórico. El objetivo de este trabajo de tesis fue optimizar la producción de PHB y P(3HB-co-3HV) por H. seropedicae Z69 mediante el aumento del rendimiento de transformación de glucosa y propionato de sodio en polímero. Se plantearon dos estrategias. Una de ellas abarca la eliminación de las rutas catabólicas del propionil-CoA mediante ingeniería genética. Se construyó un mutante (Z69Prp) en la enzima 2-metilcitrato sintasa (PrpC) del ciclo del 2-metilcitrato (2MCC) para el catabolismo del propionato, Z69Prp fue incapaz de crecer en propionato de sodio y en cultivos con glucosa-propionato fue capaz de acumular 50% de copolímero, con 8,6 mol% de 3HV, mayor al de la cepa control (1 mol%). El rendimiento obtenido fue 0,44 g/g, por debajo del rendimiento teórico (1,35 g/g). Este rendimiento teórico se calcula asumiendo que todo el ácido propónico se transforma en monómeros de 3HV. 4 En el caso de glucosa se implementó una estrategia de análisis de rutas metabólicas mediante análisis de modos elementales de flujos (AMEF). Se analizó el crecimiento y producción de PHB por la cepa Z69 en cultivos continuos y en lote en bio-reactor, utilizando glucosa como fuente de carbono. Los parámetros analizados en los cultivos continuos permitieron determinar que la acumulación de PHB está parcialmente asociada al crecimiento. Los cultivos en lote presentaron un perfil donde la fase exponencial se comportaba como un período pseudo-estacionario. Los datos de los cultivos continuos y del período pseudo-estacionario fueron usados para desarrollar un análisis de MEF. Los datos de los cultivos continuos generaron 9 modos elementales (ME) y los del cultivo en lote fueron 13. En ambos casos fue posible identificar un ME el cual se ajustó mejor a los datos experimentales, con un flujo de carbono por la vía de Embden Doudoroff (ED) lineal. Por otro lado, el ME que maximiza la producción de PHB posee el mayor flujo por la vía de ED cíclica. El funcionamiento cíclico de ED generaría más poder reductor como NADPH, lo cual está de acuerdo con los requerimientos de precursores para la síntesis de PHB. A partir de los MEF, se determinó una correlación positiva entre el flujo por la enzima fructosa 1,6 bifosfatasa (FbPasa) y el rendimiento de transformación de glucosa en PHB. El aumento en el número de copias del gen fbp que codifica para dicha enzima en Z69(pRK767::fbp) se tradujo en un leve aumento en la actividad fructosa 1,6 bifosfatasa. Los cultivos en lote en condiciones de bio-reactor de la cepa Z69(pRK767::fbp) presentaron una menor velocidad de crecimiento con un rendimiento YPHB/glu mayor que la cepa control. Sin embargo, el YPHB/glu obtenido fue muy bajo y alejado del valor esperado por el análisis de modos elementales de flujo. Este trabajo de tesis permitió avanzar en el conocimiento de H. seropedicae en cuanto a su metabolismo carbonado, fisiología y síntesis de PHAs. Esto permitirá diseñar una estrategia de cultivos (alimentados o continuos) que aumente la producción de PHAs y la eficiencia en el uso del sustrato carbonadoUdelar. FQ2022-06-15T13:34:20Z2022-06-15T13:34:20Z201620220615Tesis de doctoradoinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersion203 p.application/pdfCatalán, A. Desarrollo de estrategias dirigidasa modificarel metabolismo de Herbaspirillum seropedicae para mejorar la producciónde polihidroxialcanoatos [en línea] Tesis de doctorado. Montevideo : Udelar. FQ, 2016.https://hdl.handle.net/20.500.12008/32098reponame:COLIBRIinstname:Universidad de la Repúblicainstacron:Universidad de la RepúblicaesspaLas obras depositadas en el Repositorio se rigen por la Ordenanza de los Derechos de la Propiedad Intelectual de la Universidad De La República. (Res. Nº 91 de C.D.C. de 8/III/1994 – D.O. 7/IV/1994) y por la Ordenanza del Repositorio Abierto de la Universidad de la República (Res. Nº 16 de C.D.C. de 07/10/2014)info:eu-repo/semantics/openAccessLicencia Creative Commons Atribución – No Comercial – Sin Derivadas (CC BY-NC-ND 4.0)oai:colibri.udelar.edu.uy:20.500.12008/320982026-04-14T10:16:48Z |
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