Desarrollo de inhibidores de sistemas proteína-ligando : estudio del caso de metiltransferasas
El virus del dengue es el causante de la enfermedad del dengue que afecta a millones de personas a nivel mundial. Este virus, perteneciente a la familia Flaviviridae, codifica la proteína no estructural de la subunidad NS5 con actividad metiltransferasa (NS5-Mtasa). Ésta realiza dos metilaciones con...
I tiakina i:
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|---|---|
| Hōputu: | doctoralThesis |
| Reo: | Pāniora |
| I whakaputaina: |
2025
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| Ngā marau: | |
| Urunga tuihono: | https://hdl.handle.net/20.500.12008/50227 |
| Ngā Tūtohu: |
Kāore He Tūtohu, Me noho koe te mea tuatahi ki te tūtohu i tēnei pūkete!
|
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| description | El virus del dengue es el causante de la enfermedad del dengue que afecta a millones de personas a nivel mundial. Este virus, perteneciente a la familia Flaviviridae, codifica la proteína no estructural de la subunidad NS5 con actividad metiltransferasa (NS5-Mtasa). Ésta realiza dos metilaciones consecutivas en la caperuza del extremo 5’ del ARN mensajero (ARN-cap5’), utilizando Sadenosilmetionina (SAM) como co-factor. La presente tesis doctoral se centró en el desarrollo de inhibidores de la NS5- Mtasa del virus del Dengue serotipo 2 (NS5-Mtasa-Den2) a partir de la propuesta, desarrollo y optimización de un diseño racional de compuestos. Para lograr este objetivo seleccionamos 4 herramientas para el diseño racional de inhibidores: la síntesis orgánica de los compuestos a evaluar; el estudio de interacción proteína-ligando mediante resonancia magnética nuclear (RMN); los ensayos biológicos para medir la actividad antiviral de los compuestos; y los modelos computacionales para evaluar los resultados obtenidos en las técnicas anteriores y poder predecir nuevos posibles inhibidores. Se desarrollaron y optimizaron las herramientas computacionales, los experimentos de RMN para el estudio de interacción proteína-ligando, así como las primeras aproximaciones en la producción de la NS5-Mtasa-Den2 a partir de la colaboración con grupos de mayor experticia en el área. Con respecto a la síntesis orgánica se llevó a cabo la búsqueda y optimización de una ruta sintética adecuada, logrando la síntesis total de 20 compuestos finales que se dividieron en tres series: A, B y C. Adicionalmente los compuestos fueron evaluados frente a la NS5-Mtasa-Den2 en un ensayo de unión a filtros (radioactive filter-binding assay (FBA), en inglés) y en cultivos celulares infectadas con el virus del dengue serotipo 2. |
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| spelling | Desarrollo de inhibidores de sistemas proteína-ligando : estudio del caso de metiltransferasasDíaz Carpintieri, Natalia MarielDiseño RacionalMetiltransferasaInhibidoresEl virus del dengue es el causante de la enfermedad del dengue que afecta a millones de personas a nivel mundial. Este virus, perteneciente a la familia Flaviviridae, codifica la proteína no estructural de la subunidad NS5 con actividad metiltransferasa (NS5-Mtasa). Ésta realiza dos metilaciones consecutivas en la caperuza del extremo 5’ del ARN mensajero (ARN-cap5’), utilizando Sadenosilmetionina (SAM) como co-factor. La presente tesis doctoral se centró en el desarrollo de inhibidores de la NS5- Mtasa del virus del Dengue serotipo 2 (NS5-Mtasa-Den2) a partir de la propuesta, desarrollo y optimización de un diseño racional de compuestos. Para lograr este objetivo seleccionamos 4 herramientas para el diseño racional de inhibidores: la síntesis orgánica de los compuestos a evaluar; el estudio de interacción proteína-ligando mediante resonancia magnética nuclear (RMN); los ensayos biológicos para medir la actividad antiviral de los compuestos; y los modelos computacionales para evaluar los resultados obtenidos en las técnicas anteriores y poder predecir nuevos posibles inhibidores. Se desarrollaron y optimizaron las herramientas computacionales, los experimentos de RMN para el estudio de interacción proteína-ligando, así como las primeras aproximaciones en la producción de la NS5-Mtasa-Den2 a partir de la colaboración con grupos de mayor experticia en el área. Con respecto a la síntesis orgánica se llevó a cabo la búsqueda y optimización de una ruta sintética adecuada, logrando la síntesis total de 20 compuestos finales que se dividieron en tres series: A, B y C. Adicionalmente los compuestos fueron evaluados frente a la NS5-Mtasa-Den2 en un ensayo de unión a filtros (radioactive filter-binding assay (FBA), en inglés) y en cultivos celulares infectadas con el virus del dengue serotipo 2.Antecedentes-- Resumen – Abstract -- Lista de abreviaturas -- Capítulo 1: Introducción y objetivos -- Capítulo 2: Estudio del sitio de unión del SAM a la NS5-Mtasa-Den2. Propuesta de los análogos sintéticos – Antecedentes -- 2.1. Estudio del sitio de unión -- 2.1.1. Confirmación de que la NS5-Mtasa-DEN2 pertenece a las metiltransferasas de clase I - -2.1.2. Estudio del bolsillo de unión al SAM -- 2.2. Inhibidores reportados para flavivirus -- 2.3. Propuesta de los análogos a SAM y SFG -- Capítulo 3: Primera aproximación de a los compuestos de interés: Síntesis de la serie A – Antecedentes -- 3.1. Ruta sintética 1: Primeras aproximaciones de síntesis -- 3.2. Ruta sintética 2: Nueva estrategia sintética -- 3.3. Ruta sintética 3: Formación de la amida -- Capítulo 3: Parte experimental -- Capítulo 4: Síntesis de los compuestos de la Serie B -- Antecedentes -- 4.1. Síntesis de los compuestos de la serie B -- 4.2. Asignación de los espectros de RMN realizados. Caracterización de los compuestos sintetizados -- Capítulo 4: Parte experimental -- Capítulo 5: Síntesis de los compuestos de la Serie C – Antecedente -- 5.1. Optimización de la ruta sintética para la obtención de la serie C -- 5.1.1. Estrategias sintéticas para la obtención de derivados del triazol -- 5.1.2. Estrategias sintéticas para el acople del heterociclo triazol al compuesto 3 -- 5.2. Ruta sintética para la obtención de los compuestos de la serie C -- Capítulo 5: Parte experimental -- Capítulo 6: Estudios computacionales de los compuestos de interés frente a NS5-Mtasa-Den2 – Antecedentes -- 6.1. Primeras aproximaciones al modelo de docking -- 6.1.1. Elección del programa -- 6.1.2. Optimización del modelo de docking -- 6.1.3. Validación del método de docking MOE-GOLD -- 6.2. Estudio del poder predictivo -- 6.2.1. Estudio del poder predictivo del modelo: docking -- 6.2.2. Estudio del poder predictivo del modelo: Dinámica molecular -- 6.2.3. Estudio del poder predictivo del modelo: MM/PBSA -- 6.3. Aplicación del modelo de docking a los compuestos de interés -- Capítulo 6: Parte Experimental -- Capítulo 7: Producción y evaluación de la enzima NS5-Mtasa-Den2 – Antecedentes -- 7.1. Evaluación de las metiltransferasas de origen comercial -- 7.2. Producción de NS5-Mtasa-Den2 -- 7.3. Ensayo de actividad: Consideraciones iniciales -- 7.4. Producción del sustrato de la enzima: análogo al ARNm vira -- 7.5. Evaluación de la actividad metiltransferasa de NS5-Mtasa-Den2 utilizando el kit comercial seleccionado -- 7.5.1. Optimización del kit de actividad -- 7.5.2. Re-evaluación de la actividad metiltransferasa de NS5-Mtasa-Den2 utilizando el kit comercial optimizado -- 7.5.3. Nueva producción y evaluación de la NS5-Mtasa-Den2 -- 7.6. Optimización de la producción de NS5-Mtasa-Den2 y su evaluación biológica -- 7.6.1. Primera optimización en la producción de NS5-Mtasa-Den2 -- 7.6.2. Segunda optimización en la producción de NS5-Mtasa-Den2 -- 7.6.3. Tercer intento de producción de NS5-Mtasa-Den2 -- 7.6.4. Cuarto intento de producción de NS5-Mtasa-Den2 -- Capítulo 7: Parte experimental -- Capítulo 8: Estudio de la interacción proteína-ligando por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) – Antecedentes -- 8.1. Puesta a punto de experimento de STD-RMN -- 8.1.1. Optimización del experimento de STD-RMN -- 8.1.2. Mapa de epítopos de unión de ligando -- 8.2. Estudio por competencia en STD-RMN -- 8.3. Uso del experimento STD-RMN para los análogos propuestos -- Capítulo 8: Parte experimental -- Capítulo 9: Evaluación biológica de los compuestos sintetizados análogos al SAM y el SFG -- 9.1. Evaluación biológica: ensayo in-vitro frente a la NS5-Mtasa-Den2 -- 9.2. Evaluación biológica: ensayo in-vitro frente a células infectadas con el virus del dengue, serotipo 2 -- 9.2.1. Determinación de la citotoxicidad celular, determinación del CC50 -- 9.2.2. Evaluación de la actividad antiviral en Den2 -- 9.2.3. Resultados obtenidos -- Capítulo 9: Parte experimental -- Capíulo 10: Conclusiones y PerspectivasUdelar. FQ : PEDECIBADíaz Carpintieri Natalia Mariel2025-06-09T15:28:44Z2025-06-09T15:28:44Z2025Tesis de doctoradoinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersion454 p.application/pdfDíaz Carpintieri, N. Desarrollo de inhibidores de sistemas proteína-ligando : estudio del caso de metiltransferasas [en línea]. Tesis de doctorado. Montevideo : Udelar. FQ : PEDECIBA, 2025https://hdl.handle.net/20.500.12008/50227reponame:COLIBRIinstname:Universidad de la Repúblicainstacron:Universidad de la RepúblicaesspaLas obras depositadas en el Repositorio se rigen por la Ordenanza de los Derechos de la Propiedad Intelectual de la Universidad de la República.(Res. Nº 91 de C.D.C. de 8/III/1994 – D.O. 7/IV/1994) y por la Ordenanza del Repositorio Abierto de la Universidad de la República (Res. Nº 16 de C.D.C. de 07/10/2014)info:eu-repo/semantics/openAccessLicencia Creative Commons Atribución - No Comercial - Sin Derivadas (CC - By-NC-ND 4.0)oai:colibri.udelar.edu.uy:20.500.12008/502272026-04-14T10:16:59Z |
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