Inmunodetección de pequeños analitos con nannopeptámeros
La utilización de péptidos anti-inmunocomplejos para la detección no competitiva de pequeñas moléculas ha mostrado ser una alternativa ventajosa respecto a los formatos competitivos, dado que comúnmente aumentan la sensibilidad y especificidad, y generan una señal proporcional y por tanto intuitiva....
Zapisane w:
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| Wydane: |
2018
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| description | La utilización de péptidos anti-inmunocomplejos para la detección no competitiva de pequeñas moléculas ha mostrado ser una alternativa ventajosa respecto a los formatos competitivos, dado que comúnmente aumentan la sensibilidad y especificidad, y generan una señal proporcional y por tanto intuitiva. Inicialmente, este principio fue demostrado en formato PHAIA (Phage anti-immunocomplex assay) utilizando péptidos expresados en la superficie de partículas virales. Posteriormente, con el fin de generar reactivos más atractivos para la industria de inmunoensayos, se montaron ensayos de igual desempeño, pero sustituyendo los fagos por péptidos anti-inmunocomplejos biotinilados unidos a la estreptavidina, que llamamos nanopeptámeros. Este trabajo de tesis transcurrió dentro de este marco de antecedentes, teniendo como principales objetivos simplificar la producción de los reactivos utilizados en los ensayos no competitivos y explorar variantes de estos ensayos para potenciar aún más su desempeño como herramientas para monitoreo de analitos pequeños. La primera parte de esta tesis se centró en la producción de nanopeptámeros en forma recombinante, realizando la expresión en E. coli de péptidos fusionados a proteínas multiméricas, como estreptavidina y la verotoxina. Todos los nanopeptámeros producidos fueron funcionales y permitieron la detección de los analitos modelo, clomazone y molinato, alcanzando límites de detección equivalentes a los obtenidos con PHAIA, y con el potencial de ser aplicados en formatos de tiras de diagnóstico para detección rápida e in-situ. Como resultado de lo anterior se estableció una plataforma tecnológica dedicada a la detección de pequeñas moléculas y que consiste en una instancia de selección de péptidos anti-inmunocomplejos con evaluación de su desempeño en PHAIA, seguido de la generación de nanopeptámeros, y finalmente montaje y validación de los inmunoensayos al analizar muestras reales. Dicha plataforma fue transferida como tal a la industria, para lo cual, en la segunda etapa de esta tesis se realizó una prueba de concepto que no se describe aquí debido a acuerdos de confidencialidad. Como alternativa al formato heterogéneo en placa de ELISA, la tercera parte de este trabajo consistió en el montaje de los ensayos no competitivos en formatos homogéneos (mix-and-read). La tecnología de ensayos homogéneos, AlphaLisa, basada en la generación de luminiscencia mediante canalización de oxígeno (LOCI), fue la elegida para ser acoplada a los ensayos no competitivos. Con el herbicida atrazina como modelo se montó el inmunoensayo NanoAlphaLisa. En este sistema, el analito es reconocido por el anticuerpo inmovilizado en las microesferas (beads) aceptoras, y el inmunocomplejo así formado estabiliza su unión a las beads dadoras cubiertas con los correspondientes nanopeptámeros anti-inmunocomplejo. De esta forma al irradiar las beads dadoras el oxígeno singlete liberado induce la generación de luminiscencia en las beads aceptoras dando lugar a un ensayo con señal proporcional a la concentración del analito, que fue validado con muestras de aguas superficiales. En la última instancia de esta tesis se apuntó a complementar la tecnología de nanopeptámeros utilizando fragmentos de anticuerpos recombinantes, como alternativa a los anticuerpos convencionales aplicados en los ensayos anteriores. Utilizando cocaína como analito modelo, se realizaron construcciones de bibliotecas de Fab quiméricos pollo/humano y se aisló un Fab anti-cocaína. La reactividad de este Fab se caracterizó en un formato competitivo, alcanzando un límite de detección inferior a los valores guía para el control de consumo, y con reactividad despreciable por su metabolito principal, benzoilecgonina, lo cual tiene relevancia para detectar consumo reciente. Además de su potencial para el desarrollo de un test de detección de cocaína en muestras de saliva, este Fab podrá utilizarse para la selección de péptidos anti-inmunocomplejos y la consecuente generación de los nanopeptámeros respectivos. Generar ensayos no competitivos con fragmentos de anticuerpos abriría nuevas oportunidades de innovación, como por ejemplo el desarrollo de ensayos homogéneos FRET como una alternativa de menor costo del NanoAlphaLisa. |
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Este trabajo de tesis transcurrió dentro de este marco de antecedentes, teniendo como principales objetivos simplificar la producción de los reactivos utilizados en los ensayos no competitivos y explorar variantes de estos ensayos para potenciar aún más su desempeño como herramientas para monitoreo de analitos pequeños. La primera parte de esta tesis se centró en la producción de nanopeptámeros en forma recombinante, realizando la expresión en E. coli de péptidos fusionados a proteínas multiméricas, como estreptavidina y la verotoxina. Todos los nanopeptámeros producidos fueron funcionales y permitieron la detección de los analitos modelo, clomazone y molinato, alcanzando límites de detección equivalentes a los obtenidos con PHAIA, y con el potencial de ser aplicados en formatos de tiras de diagnóstico para detección rápida e in-situ. Como resultado de lo anterior se estableció una plataforma tecnológica dedicada a la detección de pequeñas moléculas y que consiste en una instancia de selección de péptidos anti-inmunocomplejos con evaluación de su desempeño en PHAIA, seguido de la generación de nanopeptámeros, y finalmente montaje y validación de los inmunoensayos al analizar muestras reales. Dicha plataforma fue transferida como tal a la industria, para lo cual, en la segunda etapa de esta tesis se realizó una prueba de concepto que no se describe aquí debido a acuerdos de confidencialidad. Como alternativa al formato heterogéneo en placa de ELISA, la tercera parte de este trabajo consistió en el montaje de los ensayos no competitivos en formatos homogéneos (mix-and-read). La tecnología de ensayos homogéneos, AlphaLisa, basada en la generación de luminiscencia mediante canalización de oxígeno (LOCI), fue la elegida para ser acoplada a los ensayos no competitivos. Con el herbicida atrazina como modelo se montó el inmunoensayo NanoAlphaLisa. En este sistema, el analito es reconocido por el anticuerpo inmovilizado en las microesferas (beads) aceptoras, y el inmunocomplejo así formado estabiliza su unión a las beads dadoras cubiertas con los correspondientes nanopeptámeros anti-inmunocomplejo. De esta forma al irradiar las beads dadoras el oxígeno singlete liberado induce la generación de luminiscencia en las beads aceptoras dando lugar a un ensayo con señal proporcional a la concentración del analito, que fue validado con muestras de aguas superficiales. En la última instancia de esta tesis se apuntó a complementar la tecnología de nanopeptámeros utilizando fragmentos de anticuerpos recombinantes, como alternativa a los anticuerpos convencionales aplicados en los ensayos anteriores. Utilizando cocaína como analito modelo, se realizaron construcciones de bibliotecas de Fab quiméricos pollo/humano y se aisló un Fab anti-cocaína. La reactividad de este Fab se caracterizó en un formato competitivo, alcanzando un límite de detección inferior a los valores guía para el control de consumo, y con reactividad despreciable por su metabolito principal, benzoilecgonina, lo cual tiene relevancia para detectar consumo reciente. Además de su potencial para el desarrollo de un test de detección de cocaína en muestras de saliva, este Fab podrá utilizarse para la selección de péptidos anti-inmunocomplejos y la consecuente generación de los nanopeptámeros respectivos. Generar ensayos no competitivos con fragmentos de anticuerpos abriría nuevas oportunidades de innovación, como por ejemplo el desarrollo de ensayos homogéneos FRET como una alternativa de menor costo del NanoAlphaLisa.Udelar. FQ2022-06-15T13:34:29Z2022-06-15T13:34:29Z201820220615Tesis de doctoradoinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionapplication/pdfLassabe, G. Inmunodetección de pequeños analitos con nannopeptámeros [en línea] Tesis de doctorado. Montevideo : Udelar. FQ, 2018.https://hdl.handle.net/20.500.12008/32125reponame:COLIBRIinstname:Universidad de la Repúblicainstacron:Universidad de la RepúblicaesspaLas obras depositadas en el Repositorio se rigen por la Ordenanza de los Derechos de la Propiedad Intelectual de la Universidad De La República. (Res. Nº 91 de C.D.C. de 8/III/1994 – D.O. 7/IV/1994) y por la Ordenanza del Repositorio Abierto de la Universidad de la República (Res. Nº 16 de C.D.C. de 07/10/2014)info:eu-repo/semantics/openAccessLicencia Creative Commons Atribución – No Comercial – Sin Derivadas (CC BY-NC-ND 4.0)oai:colibri.udelar.edu.uy:20.500.12008/321252026-04-14T10:16:49Z |
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